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      利用MD微孔板讀板機對細胞內氧化自由基吸收能力(ORAC)進行分析
      點擊次數:6278 發布日期:2018-11-14  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

      引言

      活性氧簇 (Reactive oxygen species, ROS) 是由細胞內正常代謝反應,環境壓力 以及紫外輻射產生的一類物質,包括過氧 自由基、羥基自由基、超氧離子和單線態 氧。氧化自由基吸收能力 (oxygen radical absorbance capacity,ORAC) 分析是一 種用來評估生理液、食品、飲料以及天然 產物抗氧化能力的標準方法,它可以定量 檢測樣品清除自由基的能力。通常自由基 能夠與細胞內組分發生反應,破壞正常組 織,引起基因突變,破壞細胞周期正常運 轉,導致癌癥和其他疾病。
      這里我們展示的是如何利用 Molecular Devices 熒光微孔板讀板機 Gemini™ XPS 及SoftMax Pro 軟件聯合 Cell Biolabs 的 OxiSelect™ ORAC Assay 來檢測不同果汁 的抗氧化能力,并突出了該方法簡單易行 的特點。

      檢測原理

      該檢測是基于由偶氮二異丁脒鹽酸鹽 (2, 2’-azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride,AAPH) 熱解產生的過氧 自由基,在氧自由基吸收物質存在的條件 下與熒光素反應,從而影響熒光信號強度 這一原理的。氧自由基吸收物質的能力越 強,清除的過氧自由基也就越多,熒光信 號持續的時間也就越長。為了獲得待測樣 品的抗氧化能力,可在熒光強度對時間作 圖的曲線中,計算樣品曲線下方的 區域面 積,并扣除空白樣品曲線下方的區域面積 得到結果。最終結果以一種維生素E的類 似物 Trolox™ 的抗氧化能力表示。

      材料

      • Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑 盒,Part No. STA-345
      • MD 熒光微孔板讀板機 Gemini™ XPS
      • Greiner FLUOTRAC™ 200 全黑微孔板
      • 待測樣品:白蔓越橘汁,白葡萄汁,橙汁, 石榴汁,藍莓汁,紅酒

      方法

      以下步驟根據 Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑盒中的操作流程建立。

      試劑制備

      熒光素探針制備:將試劑盒中所提供的熒光 素探針用所提供的分析稀釋液稀釋 100 倍, 混勻后標記為 1×熒光素工作液。
      分析稀釋液制備:分析稀釋液按 1:4 的比 列用去離子水稀釋混勻,稀釋后的液體可 為所有樣品和標準品稀釋所用,4℃保存。 樣品制備:果汁和紅酒樣品預先 4℃ 離心 10 分鐘 (5-10,000 x g) 去除顆粒,隨后上 清在分析檢測前稀釋 100 到 1000 倍。

      抗氧化劑標準曲線繪制

      所需標準品濃度可通過稀釋 1000 μM 的抗 氧化劑標準品儲液來獲得,現配現用。濃 度梯度稀釋關系如表 1 所示,零濃度 Trolox 標準品可作為空白對照。
      注:每個標準品和待測樣品均需要準備 2 或 3 個復孔用于分析。每次分析都需要新鮮配 制標準品。

      分析步驟

      1. 25  μL 抗氧化劑標準品和樣品加入 96 孔板 中,每個樣品 2 個復孔。
      2. 每孔加入 150 μL 1×熒光素工作液,微孔 板充分混勻后放入預熱的微孔板讀板機中 37℃ 孵育 30 分鐘。
      3. 用多道移液器移取 25 μL 自由基起始液至 每孔中。
      4. 加入自由基起始液后立即震板 15 秒以便混 勻液體。微孔板在讀板前需在儀器上震板 5 秒。
      5. 利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板 機 Gemini™ XPS 讀取每孔的動力學熒光信 號。在 SoftMax Pro 軟件中激發光波長設為 485 nm,發射光波長設為 520 nm,cutoff 設為 515 nm。微孔板一次整板讀取時間為 1 分鐘,總共持續 60 分鐘。
      注:到分析結束時,最終熒光信號強度應小 于初始熒光強度的 10%,否則應提高樣品的 稀釋倍數重新檢測。

      結果計算

      1. 利用 SoftMax Pro 軟件計算每個樣品和標 準品的曲線下方區域面積 (Area under the curve,AUC)。
      2. 每個樣品和標準品的凈 AUC 應當通過扣 除空白對照的 AUC 獲得。
      3. 以凈 AUC 值為縱軸,Trolox 抗氧化劑標 準品濃度為橫軸作圖。
      4. 待測樣品的 Trolox 濃度當量 ( TE,單位 μM ) 可根據標準曲線計算獲得,結果用 μM TE/mL 表示。

      結果

      標準曲線繪制及數據分析均采用 SoftMax Pro 軟件處理。Trolox 標準品的動力學曲線如圖 1 所示。每個標準品的凈 AUC 通過扣除空白 對照的 AUC 獲得。圖 2 顯示的是每個 Trolox 標準品的凈 AUC 對濃度作圖獲得的標準曲 線。所有樣品都需要計算凈 AUC。從 Trolox 標準曲線算出每個樣品的 ORAC 值⸺以 Trolox 濃度當量 ( TE,單位 μM ) 表示,并 乘以各自的稀釋倍數算出最終 ORAC 值, 單位 μMTE/mL。稀釋 100 倍的樣品的信號 值超出標準曲線范圍,稀釋 1000 倍的樣品 的信號值在標準曲線范圍內,其 ORAC 值如 表 2 所示。待測樣品中紅酒的 ORAC 值最高, 而的白蔓越橘汁 ORAC 值最低。需要注意的 是來自不同制造商生產出的產品的組分可能 不同,會引起樣品 ORAC 值的不同。

      總結

      利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板機 Gemini™ XPS 可以方便地進行 Cell Biolabs 的 OxiSelect™ ORAC 分析,同時儀器配套 的 SoftMax Pro 軟件可以自動計算結果并 完成標準曲線繪制。
      需要注意的是 Molecular Devices 其他多 功能微孔板讀板機如 (SpectraMax M2、 M2e、M3、M4、M5、M5e、Paradigm®) 以及 FilterMax™ F5 都能夠提供熒光檢測 模式,且都可以進行OxiSelect ORAC 分 析。FlexStation® 3 臺式多功能微孔讀板 機還能夠進行自動化加樣。
      StakMax® 微孔板堆板機可與 SpectraMax Gemini 系列以及 M 系列微孔讀板機整合使 用以提高通量。

      References

      1. Huang, D., Ou, B., and Prior, R.L. (2005). The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agric. Food Chem. 53, 1841-1856.
      2. Wang, H., Cao, G., and Prior, R.L. (1996). Total antioxidant capacity of fruits. J. Agric. Food Chem. 44, 701-705.

      來源:美谷分子儀器(上海)有限公司
      聯系電話:400 820 3586
      E-mail:info.china@moldev.com

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