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      如何利用遠紅外熒光對細胞內活性氧進行檢測
      點擊次數:6910 發布日期:2018-11-14  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

      引言

      活性氧 (Reactive oxygen species,ROS) 是 一類由細胞有氧代謝產生的具有化學反應 活性的一類含氧分子,參與細胞信號轉 導、免疫防御以及維持體內動態平衡等各 項生理活動。然而當細胞處于環境壓力 時,胞內的 ROS 含量水平就會急劇上升造 成核酸、蛋白和脂類物質的氧化損傷[1], 從而引起許多生理、病理變化,諸如男性 不育、癌癥的發生等等[2]。
      胞內 ROS 含量水平通常采用熒光探針,尤 其綠色熒光探針來檢測。然而由于綠色熒 光檢測和成像易受細胞自發熒光的影響[3], 因此遠/近紅外染料常被用來檢測 ROS 含 量從而避免細胞自發熒光的干擾。
      SpectraMax® iD5 多功能微孔讀板機采用超 冷型 PMT 和“2X2”光柵光路設計,可有效 降低信號背景減少雜散光,為遠紅外熒光 檢測提供更寬的動態范圍和更高的靈敏 度。
      這里我們展示的是如何利用 SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機和 2 個熒光檢測試劑盒來 進行胞內 ROS 含量分析的。在 Spectral Optimization Wizard 幫助下,我們優化 了遠紅外分析檢測下激發光和發射光的不 同波長組合,并最終比較了綠色熒光檢測 和遠紅外熒光檢測結果的表現

      優勢

      • 一步均相熒光法可快速檢測胞 內活性氧
      • 超冷型 PMT 可進一步降低背景 噪聲并增強實驗表現
      • Spectral Optimization Wizard  可優化激發和發射光波長

      材料

      • Cell Meter™ 熒光胞內總 ROS 活性檢測 試劑盒 *深紅色熒光* (AAT Bioquest cat. #22903)
      • Cell Meter™ 熒光胞內總 ROS 活性檢測 試劑盒 *綠色熒光* (AAT Bioquest cat. #22900)
      • HEK293 細胞 (AATC cat. #CRL-1573)
      • 甲萘醌 (Sigma cat. #M9429-25G)
      • 96 孔組織培養板,黑邊底透 (Greiner cat. #655087)
      • SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機 (Molecular Devices cat. #iD5)

      方法

      HEK 293 細胞鋪板于 96 孔細胞培養板中, 每孔 1 萬個細胞,37 ℃ 培養 24 小時。隨 后細胞經甲萘醌濃度梯度處理 1 個小時, 甲萘醌起始濃度為 25 μM,倍比稀釋系數為 2。最后細胞經 Cell Meter 深紅色熒光 ROS 檢測試劑或 Cell Meter 綠色熒光 ROS 檢測 試劑處理,37 ℃ 培養 30 分鐘。
      由于 Cell Meter 深紅色熒光 ROS 檢測試劑 盒所推薦的激發光和發射光波長相距太近 (658/675 nm),與 SpectraMax iD5 多功 能微孔讀板機不太兼容,因此本實驗激發 /發射采用預估的 625/700 nm,以便激發 /發射帶寬有足夠距離且產生足夠的熒光 信號 ( 圖 1 )。
      SoftMax® Pro 軟件的 Spectral Optimization Wizard 能夠為遠紅外分析自動計算出更合適 的激發/發射波長,Read Height Optimization 設置能夠找出更合適的的讀板高度。實驗 所用的波長和 PMT 增益設置如表 1 所 示,數據和圖片均采用 SoftMax® Pro 軟件 產生。

      結果

      甲萘醌通過阻斷線粒體電子傳遞鏈的不同部分 使得胞內 ROS 含量積聚[4],因此當其濃度增加 時胞內的 ROS 含量也會相應增加。Cell Meter 深紅色熒光 ROS 檢測試劑盒和綠色熒光 ROS 檢測試劑盒都能夠得出甲萘醌劑量反應曲線 并且有相似的 EC50 ( 圖 2、3 )遠紅外分析所用 的激發/發射波長經 Spectral Optimization Wizard 優化,可獲得本次實驗中最優的 Z 因 子 ( 表 2 )。

      結論

      對于胞內熒光檢測 ROS 含量實驗來說, 使用 SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機結合 SoftMax® Pro 分析軟件是一個非常有力的手 段。軟件中的 Spectral Optimization Wizard 和 Read Height Optimization 能自動優化實驗條 件以獲得更好的實驗結果。盡管 SpectraMax iD5 能夠有效對胞內 ROS 含量進行綠色熒光檢 測和遠紅外熒光檢測,然而后者結合激發/發射 波長優化設置表現出較前者更為優異的 Z 因子。

      References

      1. Hancock, J. T., R. Desikan, and S. J. Neill. "Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways." Biochem Soc Trans. (2001) May; 29 (Pt 2): 345-50.
      2. Ogawa K, Suzuki K, Okutsu M, Yamazaki K, Shinkai S. The association of elevated reactive oxygen species levels from neutrophils with low-grade inflammation in the elderly. Immunity & Ageing: I & A. 2008; 5:13. doi:10.1186/ 1742-4933-5-13.
      3. Lin, Michael Z. "Beyond the rainbow: new fluorescent proteins brighten the infrared scene." Nature Methods 8.9 (2011): 726.
      4. Kolesova, G. M., L. V. Karnaukhova, and L. S. Iaguzhinskiĭ. "Interaction of menadione and duroquinone with Q-cycle during DTdiaphorase function." Biokhimiia (Moscow, Russia) 56.10 (1991):1779 -1786.

      來源:美谷分子儀器(上海)有限公司
      聯系電話:400 820 3586
      E-mail:info.china@moldev.com

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